Fils de Samuel Steinlen, employé des Postes lausannois, et petit-fils d'un peintre d'origine allemande, il abandonne ses études de théologie à l'Université de Lausanne après deux ans pour se tourner vers l'art. Sa formation au dessin d'ornement industriel à Mulhouse lui donne les bases techniques qu'il développera dans sa carrière parisienne.
Installé sur la butte Montmartre dès 1883 avec sa femme Émilie, il s'intègre rapidement au milieu artistique bohème. Ses amitiés avec Adolphe Willette, Antonio de La Gandara et sa fréquentation assidue du cabaret le Chat Noir l'amènent à côtoyer les figures emblématiques de l'époque. Il expose au Salon des indépendants dès 1893 et au Salon des humoristes.
Son engagement social transparaît dans son œuvre : adversaire de l'injustice, il représente les scènes de rue, d'usines et de mines, donnant une voix visuelle aux mendiants, ouvriers, gamins dépenaillés et prostituées. Privilégiant le dessin et le pastel, il influence des artistes comme Jean Peské et Pablo Picasso par sa représentation de la vie quotidienne.
Parallèlement à ses célèbres dessins de chats "dans toute leur fantaisie", il développe une œuvre gravée et affichiste remarquable. Ses illustrations littéraires et collaborations avec divers journaux humoristiques établissent sa réputation. En 1911, il fonde Les Humoristes avec Jean-Louis Forain et Charles Léandre.
Ses convictions libertaires l'amènent à illustrer des ouvrages anarchistes et militer pour les syndicats d'artistes. En 1915, malgré son âge avancé, il se rend au front pour témoigner de la condition des soldats. En 1917, missionné par La Mission Artistique aux Armées, il concentre ses dessins sur la misère militaire et l'exode civil, documentant avec humanité les horreurs de la Grande Guerre. Il s'éteint en 1923 et repose au cimetière Saint-Vincent.
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